Vitamin D di dalam serum: analisis menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra

Serum Vitamin D: Analysis using ultra performance liquid chromatography

Written by: Junaida Osman & Dr. Chin Siok-Fong

Date published: 16 April 2020

Kekurangan vitamin D bukan sahaja memberi kesan terhadap kesihatan muskuloskeletal, tetapi juga mempunyai perkaitan dengan pelbagai penyakit akut dan kronik. Antaranya adalah peningkatan risiko terhadap penyakit diabetes melitus, penyakit kardiovaskular, sesetengah penyakit kanser, komplikasi ibu mengandung, penyakit autoimun dan alergi.

Secara umum, vitamin D di dalam badan manusia terdiri daripada vitamin D₃ dan vitamin D_2. Vitamin D₃ disintesis secara semulajadi di dalam lapisan kulit akibat kesan tindak balas pendedahan cahaya matahari yang mempunyai unsur radiasi UVB. Vitamin D₂ pula diperolehi melalui diet pemakanan daripada sumber haiwan dan tumbuhan, makanan atau minuman yang telah diperkaya dengan vitamin D₂ dan suplemen tambahan.

Vitamin D adalah bersifat larut lemak (hidrofobik). Kandungannya di dalam badan manusia dinilai di dalam bentuk 25-hidroksivitamin D (25OHD) kerana sifatnya yang mempunyai jangka hayat dalam badan yang lebih lama berbanding bentuk vitamin D yang lain, iaitu selama lebih kurang 3 minggu. Oleh yang demikian, 25OHD adalah penanda yang baik bagi menentukan status vitamin D seseorang. Selain daripada itu, 25OHD juga telah menunjukkan tahap kestabilan molekul yang tinggi, lalu menjadikan molekul ini sangat berguna terutamanya di dalam kajian epidemiologi.

Pelbagai kaedah telah dibangunkan oleh para penyelidik untuk menentukan status vitamin D di dalam badan manusia. Antara asai yang biasa digunakan dalam menentukan nilai vitamin D di dalam darah adalah teknik imunologi (CPBA, EIA dan RIA) dan teknik bukan imunologi (HPLC dan LC-MS). Teknik imunologi lebih kerap digunakan secara rutin kerana kos yang lebih rendah. Walaupun begitu, teknik ini kebiasaannya mengukur 25OHD tanpa dapat membezakan nilai 25OHD₂ dan 25OHD₃. Teknik secara kromatografi cecair pula adalah lebih popular dalam penyelidikan kerana dapat memisahkan kedua-dua molekul 25OHD₂ dan 25OHD₃, sekaligus memberi nilai yang berasingan bagi setiap molekul tersebut, sungguhpun kehadirannya pada aras yang rendah. Ini menunjukkan bahawa teknik kromatografi cecair adalah lebih sensitif dan spesifik bagi penentuan vitamin D. Kebiasaannya, pemisahan komponen 25OHD₂ dan 25OHD₃ dilakukan dengan menggunakan kolum yang telah dimampatkan dengan partikel C18, manakala pengesanannya melalui pengukuran spektra yang terhasil.

Di UMBI, analisis vitamin D dilakukan ke atas sampel serum darah dengan menggunakan kaedah kromatografi cecair berprestasi ultra (UPLC). Kaedah ini telah dibangunkan di dalam makmal UMBI dan telah divalidasi dengan mengikut garis panduan yang ditetapkan oleh ICH dan FDA. Pada masa ini, analisis vitamin D diaplikasi secara rutin di UMBI, malah ditawarkan sebagai perkhidmatan tambahan untuk pelanggan yang menjalani saringan kesihatan di Pusat Saringan Kesihatan UMBI.

Kaedah penentuan vitamin D melalui UPLC merangkumi beberapa proses utama iaitu pemprosesan sampel, pengekstrakan vitamin D, pemisahan dan pengesanan molekul vitamin D, pembinaan graf piawai dan analisis data. Sampel darah dipisahkan kepada lapisan serum dan sel darah melalui pemisahan oleh gel di dalam tiub darah yang diempar. Seterusnya, vitamin D diekstrak daripada serum yang diperolehi.

Pengekstrakan vitamin D dimulakan dengan proses pemendakan protein di dalam serum dengan menggunakan pelarut jenis tidak polar, metanol. Pemendakan protein yang berlaku ini adalah disebabkan oleh perubahan cas elektrostatik; iaitu air pada permukaan protein digantikan dengan pelarut organik (metanol) yang seterusnya menyebabkan proses pengagregatan protein. Vitamin D yang terlarut di dalam metanol seterusnya diekstrak sebanyak dua kali dengan menggunakan pelarut tidak polar, n-heksana. Lapisan n-heksana yang membentuk lapisan paling atas kemudiannya dipindahkan ke dalam tiub baru dan dikeringkan secara vakum dengan suhu yang terkawal pada 4 darjah Celcius. Ekstrak kering ini dilarutkan dengan pelarut asetonitril dan ditapis dengan membran PTFE yang bersaiz 0.2 μm. Sampel-sampel ini seterusnya disuntik ke dalam sistem UPLC secara tetapan automatik.

Kepekatan vitamin D di dalam serum ditentukan daripada graf piawai yang dibina dengan menggunakan albumin serum bovin. Jadual 1 menunjukkan penetapan kromatografik yang digunakan untuk analisis vitamin D.

Jadual 1. Penetapan kromatografik yang digunakan untuk  analisis vitamin D.

Kompaun kimia dodecanophenone digunakan sebagai piawai dalaman (IS) dan ditambahkan ke dalam setiap larutan piawai vitamin D (yang digunakan untuk kalibrasi) dan sampel pada kuantiti yang tetap sebelum proses pengekstrakan dijalankan (Rajah 1). Penggunaan IS dalam analisis terutamanya di dalam teknik kromatografi cecair adalah penting untuk mengawal faktor kehilangan sampel semasa pengekstrakan dilakukan. Ini seterusnya dapat memastikan kepersisan dan kejituan di dalam kualiti analisis kuantitatif yang dilakukan. Penentuan kepekatan vitamin D dilakukan dengan mengira nisbah keluasan di bawah graf bagi 25OHD₃ dan 25OHD₂ kepada keluasan di bawah graf bagi IS. Nilai nisbah yang diperolehi ini, dibandingkan dengan graf piawai untuk mendapatkan kepekatan vitamin D di dalam sampel.

Rajah 1.    Graf kromatografi bertindan menunjukkan siri kepekatan vitamin D untuk graf piawai. (A) 25OHD₃ dan (B) 25OHD₂; 12.5, 25, 50, 100, 150 dan 200 nM 25OHD di dalam albumin serum bovin yang telah ditambah dengan 25 μM IS.

Secara umum, status nilai 25OHD di dalam darah boleh dibahagikan kepada beberapa kategori; kurang dari 30 nM (deficient), antara 30 hingga 50 nM (insufficient) dan lebih dari 50 nM (adequate). Walau bagaimanapun, bagi seseorang yang mempunyai nilai bacaan 25OHD yang melebihi 150 nM, risiko toksisiti boleh berlaku dengan kesan yang berkaitan dengan peningkatan aras kalsium di dalam badan.

Penggunaan UPLC berupaya meningkatkan kebolehpercayaan dalam penentuan kedua-dua 25(OH)D3 dan 25(OH)D2. Oleh itu, selaras dengan peningkatan kajian terhadap perhubungan di antara aras vitamin D dan status kesihatan, kaedah penentuan 25OHD menggunakan UPLC adalah sangat bertepatan untuk dijadikan sebagai amalan rutin makmal.

Rujukan:

Singkatan:

CPBA  :           Competitive protein binding assay

EIA      :           Enzyme immunoassay

FDA     :           Food and Drug Asministration

PTFE   :           Polytetrafluoroethane

HPLC  :           High performance liquid chromatography

ICH      :           International Council on Harmonisation for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

IS         :           Internal standard

LC-MS :           Liquid chromatography-mass spectrometry

PDA     :           Photo diode array

RIA      :           Radio immunoassay

UPLC  :           Ultra performance liquid chromatography